تست PCR از جمله آزمایش های مهم به شمار می رود که احتمالا نام آن را شنیده باشید. این آزمایش کاربرد گسنرده ای در زمینه پزشکی داشته و علاوه بر تشخیص بیماری ویروسی کوید از آن برای تشخیص انواع جهش های ژنتیکی، بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA و… استفاده کرد.
استفاده از این روش مزایای بسیاری به همراه داشته که از جمله این مزایا می توان به ساده بودن روش تست و تفسیر سریع نتایج اشاره کرد. البته این تست از جمله تست هایی است که می توان آن را به کمک تیم حرفه ای لیما طب در منزل انجام داده و نتایج را به صورت آنلاین از پروفایل شخصی مشاهده کرد. برای اطلاعات بیشتر و علمی تر از تست PCR با لیما طب همراه باشید.
آزمایش PCR چیست؟
فهرست عناوین صفحه:
در دنیای امروز که بیماری ها به سرعت در حال گسترش هستند، تشخیص زود هنگام و دقیق بیماری ها از اهمیت بالایی برخوردار است. یکی از روش های دقیق و حساس تشخیص بیماری ها، تست PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز است. این تکنیک قدرتمند در زمینه پزشکی، زیست شناسی و علوم مرتبط، به عنوان ابزاری ضروری برای تشخیص انواع مختلف بیماری ها، از جمله عفونت های ویروسی و باکتریایی، بیماری های ژنتیکی و سرطان، مورد استفاده قرار می گیرد.
تست PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز، از جمله قدرتمند ترین آزمایش های موجود در زیست شناسی مولکولی است که به ما اجازه می دهد تا قطعات خاصی از DNA را تکثیر کنیم. این تکنیک کاربرد های گسترده ای در پزشکی و… دارد.
مراحل pcr
تست pcr روشی برای تکثیر قطعات خاصی از DNA است که این تکنیک که در پزشکی زیست شناسی و علوم مرتبط استفاده می شود همچنین در تشخیص بیماری ها، تحقیقات ژنتیکی و بسیاری از کاربرد های دیگر نقش مهمی دارد. تست PCR شامل چندین مرحله اساسی است که به طور مکرر تکرار می شوند تا تعداد نسخه های قطعه مورد نظر DNA به میزان قابل توجهی افزایش یابد. در زیر به مراحل اصلی pcr پرداخته ایم.
دناتوراسیون
در اولین مرحله، نمونه DNA حاوی قطعه مورد نظر در دمای بسیار بالا حرارت داده می شود. این دما باعث می شود که پیوند های هیدروژنی بین دو رشته DNA شکسته شده و دو رشته از هم جدا شوند. این مرحله به آنزیم پلیمراز اجازه می دهد تا به هر یک از رشته های تک رشته ای دسترسی پیدا کند.
اتصال آغازگر ها
پس از دناتوراسیون، دما کاهش می یابد تا پرایمر ها بتوانند به رشته های تک رشته ای DNA متصل شوند. آغازگر ها قطعات کوتاهی از DNA هستند که به طور اختصاصی به توالی مکمل خود در DNA متصل می شوند. این آغازگر ها به عنوان نقطه شروع برای سنتز رشته های جدید DNA عمل می کنند.
سنتز DNA
در این مرحله، آنزیم پلیمراز با استفاده از نوکلئوتید ها (بلوک های ساختمانی DNA) و آغازگرها یک رشته جدید DNA را در امتداد رشته الگو سنتز می کند. در نتیجه، تعداد نسخه های قطعه مورد نظر DNA دو برابر می شود.
این سه مرحله به طور مداوم تکرار می شوند تا تعداد نسخه های قطعه به میزان مورد نظر برسد. معمولاً این چرخه ها بین ۲۵ تا ۴۰ بار تکرار می شوند. در هر چرخه، تعداد نسخه های DNA دو برابر می شود، بنابراین در پایان واکنش، تعداد بسیار زیادی از نسخه های قطعه مورد نظر DNA تولید می شود.
البته که برای انجام تست PCR، به تجهیزات خاصی نیاز است که این تجهیزات عبارتند از ترموسایکلر، دستگاهی که دما را به طور دقیق کنترل و سیکل های حرارتی را انجام می دهد. میکروپیپت برای اندازه گیری دقیق حجم های کوچک از محلول ها و همچنین لوله های PCR برای انجام واکنش.
تفسیر باند های الکتروفورز
الکتروفورز یکی از تکنیک های اصلی در زیست شناسی مولکولی است که برای جداسازی مولکول های باردار مانند DNA، RNA و پروتئین ها بر اساس اندازه و بار الکتریکی آن ها استفاده می شود. پس از انجام فرایند PCR و سایر تکنیک های جداسازی مولکول های زیستی، مرحله بعدی معمولاً تفسیر نتایج حاصل از الکتروفورز است.
در یک ژل الکتروفورز، باند ها به عنوان نوار های مشخصی ظاهر می شوند که نشان دهنده حضور یک مولکول خاص با اندازه مشخص است. تفسیر باند های الکتروفورز به عوامل مختلفی بستگی دارد، از جمله نوع ژل، اندازه مارکر مولکولی، شدت و تعداد باند.
نوع ژل (آگارز یا پلی آکریل آمید) و درصد غلظت آن بر جداسازی مولکول ها تاثیر می گذارد. مارکر مولکولی نیز یک نمونه استاندارد است که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است. با مقایسه باند های نمونه با مارکر مولکولی، می توان اندازه تقریبی قطعات DNA در نمونه را تعیین کرد.
شدت باند نشان دهنده مقدار مولکول موجود در نمونه است. یک باند قوی نشان دهنده مقدار زیاد مولکول و یک باند ضعیف نشان دهنده مقدار کم مولکول است. تعداد باند ها نشان دهنده تعداد قطعات مختلف DNA در نمونه است.
با مقایسه موقعیت باند های نمونه با مارکر مولکولی، می توان اندازه تقریبی قطعات DNA را تعیین کرد. وجود یا عدم وجود یک باند خاص می تواند نشان دهنده وجود یا عدم وجود یک قطعه خاص DNA در نمونه باشد. اگر نمونه حاوی یک قطعه DNA خاص باشد، باید یک باند واضح و مشخص مشاهده شود. وجود چندین باند می تواند نشان دهنده آلودگی نمونه یا وجود محصولات جانبی باشد. شدت باند می تواند به طور تقریبی مقدار DNA را نشان دهد.
تست PCR مخفف چیست؟
تست PCR مخفف واکنش زنجیره پلیمراز (Polymerase Chain Reaction (PCR)) است. منظور این است که در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها تکثیر از یک یا چند ژن از DNA است. این تکنیک در اواسط دهه ی ۱۹۸۰ به وسیله ی کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربرد و مزیتهای بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریبا در تمامی آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی کاربرد متداولی دارد و تمامی مشکلات قبلی در زیست شناسی مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA یکسان بود را بر طرف کرد.
PCR از نظر اصول علمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است. روش PCR تحول مهمی را در بیولوژی مولکولی پدید آورده است. با این روش میتوان قطعات DNA از سلولهای مختلف، DNA تک رشتهای یا مولکولهایRNA و حتی DNA یک سلول را تکثیر نمود
برای تشخیص ویروس کرونا نمی توان از نمونه خون استفاده کرد. خون فرد مشکوک به کرونا برای تشخیص انتی ژن و انتی بادی کاربرد دارد و برای تست PCR بایستی از بینی و حلق سواب تهیه کرد. برای چگونگی تست PCR به صفحه ی تست PCR کرونا چیست مراجعه کنید.
کاربرد های تست PCR
تست PCR کاربرد های بسیار گسترده ای در زمینه های مختلف دارد، از جمله تشخیص بیماری ها، تحقیقات ژنتیکی، تعیین رابطه خویشاوندی بین افراد، مهندسی ژنتیک و مطالعه DNA. در تشخیص بیماری ها، تشخیص عفونت های ویروسی و باکتریایی، بیماری های ژنتیکی و سرطان مورد استفاده قرار می گیرد و همچنین برای مطالعه ژن ها، جهش ها و تغییرات ژنتیکی نیز مورد استفاده قرار می گیرد.
همچنین این تست قادر به شناسایی مقادیر بسیار کم از dna بوده و به طر کلی از حساسیت بالایی برخوردار است. تست pcr نتایج را در مدت زمان بسیار کوتاهی در اختیار قرار می دهد و روش انجام آن نسبتا ساده است. این تست در بسیاری از زمینه ها قابل استفاده بوده و در حالت کلی کاربرد گسترده ای دارد. PCR بطور کلی به دو منظور اصلی به کار میرود:
تهیه نسخه های متعدد از یک ژن
بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA
کاربرد دوم PCR از اهمیت بیشتری برخوردار است. از این روش میتوان جهت تشخیص بیماریهای ژنتیکی قبل از تولد، تعیین جنسیت، بررسی عفونتهای باکتریایی و ویروسی استفاده کرد.
DNA الگو
مهمترین هدف از PCR تقویت DNA الگو میباشد. DNA الگو میتواند از ۱۰۰ تا ۳۵ هزار جفت باز طول داشته باشد. سالم بودن نمونه DNA اهمیت فراوانی در PCR دارد. همچنین کیفیت نمونه DNA، نتیجه نهایی PCR را به شدت تحت تأثیر قرار میدهد. نمونه ناخالص ممکن است حاوی عوامل مهار کننده آنزیم DNA پلیمراز باشد که موجب کاهش بازدهی واکنش میشود.
پرایمرها
یک جفت پرایمر الیگونوکلئوتیدی سنتزی که هر یک حدود 20 نوکلئوتید هستند، با نواحی مکمل خود بر روی دو رشتهی DNA هدف اتصال مییابند. پس از ترکیب شدن با DNA مورد بررسی، OH انتهای΄۳ آنها به سمت یکدیگر جهت گیری مینماید. در PCR معمولی غلظتهای ۱/۰ تا ۶/۰ میکرومولار پرایمرها برای واکنش مطلوب است.
آنزیم DNA پلیمراز
متداولترین آنزیم برای PCRهای معمولی آنزیم مقاوم به حرارت DNA پلیمراز Taq است که معمولا بین ۵/۰ تا ۵/۲ واحد در 50 میکرولیتر مخلوط PCR استفاده میشود.
dNTPs
دی اکسی نوکلئوتید 4 نوع هستند که شامل دای اکسی آدنوزین ۵ تری فسفات (dATP)، دای اکسی سیتوزین ۵ تری فسفات (dCTP)، دای اکسی گوانوزین ۵َ تری فسفات (dGTP)، دای اکسی تایمیدین ۵َ تری فسفات (dTTP) میباشند (شاه حسینی و زینلی،۱۳۸۰، کریمی و زینلی، ۱۳۸۳).
این نوکلئوتیدها به وسیلهی آنزیم DNA پلیمراز Taq بر اساس قانون بازهای مکمل واتسون و کریک به OH انتهای΄۳ پرایمر افزوده میشوند. غلظت dNTPs به فاکتورهای متعددی از جمله غلظت MgCl۲، غلظت پرایمرها، طول محصول تکثیر یافته و تعداد سیکلهای PCR بستگی دارد.
PCR buffer 10X
این بافر برای حفظpH واکنش در محدوده مناسب استفاده میشود و انواع مختلفی دارد که بسته به شرایط PCR انتخاب میشوند.
MgCl۲
یون منیزیم با اتصال به dNTPها، مجموعه محلولی ایجاد میکند که به عنوان سوبسترا برای آنزیم DNA پلیمراز Taq عمل میکند. برای کسب بهترین نتیجه غلظت MgCl۲ به صورت تجربی به دست میآید. این غلظت معمولا بین ۱ تا ۵/۱ میلی مولار است اما متداولترین غلظت MgCl۲ درPCR ، ۵/۱ میلی مولار است. اگر غلظت این ماده زیاد باشد باعث ایجاد باندهای غیراختصاصی میشود.
آب مقطر استریل
برای تامین محیط واکنش و کامل کردن حجم واکنش استفاده میشود.
مجموعه لیما طب تصمیم به ارائه خدمات آزمایش کرونا در منزل گرفته است. شما با وارد شدن به صفحه ی تست کرونا در منزل میتوانید در مدت زمان کوتاه جواب آزمایش خود را دریافت کنید.
دناتوره کردن یا واسرشت سازی
تک رشتهای شدنDNA در دمای بالاتر از دمای ذوب DNA که معمولا ۹۴ تا ۹۸درجهی سانتیگراد است، دناتوره شدن DNA دو رشتهای گفته میشود. در این دما پیوندهای هیدروژنی که دو رشته را به هم متصل میکنند، شکسته میشوند.
دمای اتصال پرایمرها
اتصال پرایمرها در دمای ۵۰ تا ۷۰ درجه ی سانتیگراد انجام میگیرد. هرچه دمای اتصال در این مرحله بالاتر باشد پرایمرها به طور اختصاصیتر به ناحیه الگو متصل خواهند شد و احتمال اتصال اشتباه پرایمر به DNA کاهش می یابد.
ساخته شدن یا طویل شدن پرایمرها
این مرحله در دمای ۷۲ درجهی سانتیگراد و به وسیلهی آنزیم DNA پلیمراز Taq کاتالیزمیگردد. آنزیم DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از جهت 3 به ۵ در کنار هم قرار میدهد و شروع به ساختن رشته های مکمل میکند.
مدت زمان این مرحله به نوع آنزیم DNA پلیمراز و طول رشته الگو بستگی دارد. این فرایند با رساندن مجدد دما به ۹۵ درجهی سانتیگراد و جدا شدن رشته ها و سپس پایین آوردن دما تا ۵۵ درجهی سانتیگراد و چسبیدن پرایمرها و بالا بردن دما تا ۷۲ درجهی سانتیگراد برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز Taq تکرار میشود و بعد از هر چرخه، تعداد رشتهها دو برابر میشود.
هر سه مرحله در دماهای مشخص و در فواصل زمانی معین انجام میشوند. چرخهها در دستگاه تغییر دهندهی حرارتی خودکار یا ترمو سایکلر که حرارت لازم برای شروع هر مرحله را فراهم میکند، ۴۰-۲۵ بار تکرار میشوند.
الکتروفورز محصولات PCR
الکتروفورز از دو کلمه الکترو به معنای برق و فورز به معنای حمل تشکیل شده است. بطور کلی به روشی گفته میشود که به کمک آن مواد باردار، در یک میدان الکتریکی از هم جدا میشوند. با توجه به باردار بودن پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک، از این روش برای جداسازی آنها استفاده میشود.
با وجود این که عمل الکتروفورز را میتوان در مایع هم انجام داد ولی چون پس از قطع جریان، نمونههای جدا شده مخلوط میشوند، این عمل را بر روی پایهی جامد یا نیمه جامد انجام میدهند.
پایهی فوق میتواند لایهی نازکی از استات سلولز باشد و یا به صورت ژل نشاسته، آگاروز یا اکریل آمید و غیره باشد. انتخاب نوع پایه بر حسب موادی که قرار است جدا شوند صورت میگیرد. به هر حال عمل نمونه گذاری معمولا در چاهکهایی که به همین منظور در ژل ایجاد شده است، انجام میگردد.
روش تهیه ژل آگاروز
برای ساخت ژل آگاروز، ابتدا پودر آگاروز را در بافر مناسبی که دارای اتیلن دی آمین تترا استیک اسید EDTA میباشد ریخته و حرارت میدهند، تا محلول شفاف و روشنی حاصل گردد.
این عمل را میتوان با گذاشتن مخلوط بافر و آگاروز در ماکروویو انجام داد. سپس محلول را تا ۶۵ درجهی سانتیگراد سرد کرده و بعد به آن، اتیدیوم بروماید با غلظت ۵/۰ میکروگرم در میلی لیتر اضافه میشود و بعد آن را درون قالب ژل الکتروفورز میریزند تا سفت گردد.
قبل از ریختن آگاروز یک شانهی پلاستیکی را درون قالب ژل آگاروز قرار میدهند. این عمل بدان جهت انجام میشود تا دندانههای شانه، چاهکهای کوچکی را در آگاروز قبل از سفت شدن تشکیل دهد.
برای تعیین فاصلهی دندانههای شانه تا کف ظرف قالب میتوان لامی را در زیر دندانههای شانه قرار داد و پس از تنظیم، لام را برداشته و آگاروز را اضافه کرد. زمانی که آگاروز ببندد، ماتریکس ضخیمی را تشکیل میدهد که به مقدار غلظت آگاروز بستگی دارد. سپس DNA مورد نظر به درون چاهکها وارد میشود. هنگامی که جریان برق از میان ژل عبور کند DNA که در pH خنثی دارای بار منفی است به طرف کاتد حرکت میکند.
موارد لازم جهت انجام PCR
برای انجام آزمایش و یا تست PCR به موارد زیر احتیاج داریم:
DNA الگو
مهمترین هدف از PCR تقویت DNA الگو میباشد. DNA الگو میتواند از ۱۰۰ تا 35 هزار جفت باز طول داشته باشد. سالم بودن نمونه DNA اهمیت فراوانی در PCR دارد. همچنین کیفیت نمونه DNA، نتیجه نهایی PCR را به شدت تحت تأثیر قرار میدهد. نمونه ناخالص ممکن است حاوی عوامل مهار کننده آنزیم DNA پلیمراز باشد که موجب کاهش بازدهی واکنش میشود.
پرایمرها
یک جفت پرایمر الیگونوکلئوتیدی سنتزی که هر یک حدود ۲۰ نوکلئوتید هستند، با نواحی مکمل خود بر روی دو رشتهی DNA هدف اتصال مییابند. پس از ترکیب شدن با DNA مورد بررسی، OH انتهای΄۳ آنها به سمت یکدیگر جهت گیری مینماید. در PCR معمولی غلظتهای ۱/۰ تا ۶/۰ میکرومولار پرایمرها برای واکنش مطلوب است.
آنزیم DNA پلیمراز
متداولترین آنزیم برای PCR های معمولی آنزیم مقاوم به حرارت DNA پلیمراز Taq است که معمولا بین ۵/۰ تا ۵/۲ واحد در ۵۰ میکرولیتر مخلوط PCR استفاده میشود. دی اکسی نوکلئوتید 4 نوع هستند که شامل دی اکسی آدنوزین ۵ تری فسفات (dATP)، دی اکسی سیتوزین ۵ تری فسفات (dCTP)، دی اکسی گوانوزین ۵َ تری فسفات (dGTP)، دی اکسی تایمیدین ۵َ تری فسفات (dTTP) هستند. این نوکلئوتیدها به وسیله ی آنزیم DNA پلیمراز Taq بر اساس قانون بازهای مکمل واتسون و کریک به OH انتهای΄۳ پرایمر افزوده میشوند. غلظت dNTPs به فاکتورهای متعددی از جمله غلظت MgCl۲، غلظت پرایمرها، طول محصول تکثیر یافته و تعداد سیکل های PCR بستگی دارد.
PCR buffer 10X
این بافر برای حفظ pH واکنش در محدوده مناسب استفاده میشود و انواع مختلفی دارد که بسته به شرایط PCR انتخاب می شوند.
MgCl۲
یون منیزیم با اتصال به dNTPها، مجموعه محلولی ایجاد میکند که به عنوان سوبسترا برای آنزیم DNA پلیمراز Taq عمل میکند. برای کسب بهترین نتیجه غلظت MgCl۲ به صورت تجربی به دست می آید. این غلظت معمولا بین ۱ تا ۵/۱ میلی مولار است اما متداول ترین غلظت MgCl۲ درPCR ، ۵/۱ میلی مولار است. اگر غلظت این ماده زیاد باشد باعث ایجاد باندهای غیراختصاصی میشود.
آب مقطر استریل
برای تامین محیط واکنش و کامل کردن حجم واکنش استفاده میشود.
[gravityform id="7" title="true"]