روش و نحوه انجام تست PCR

روش PCR در اواسط دهه ­ی ۱۹۸۰ به وسیله­ ی کری مولیس معرفی شد. به دلیل کاربرد و مزیت­ های بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد. امروزه این روش تقریبا در تمامی آزمایشگاه­ های زیست شناسی مولکولی کاربرد متداولی دارد و تمامی مشکلات قبلی در زیست شناسی مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از DNA  یکسان بوده  را بر طرف کرد.

PCR از نظر اصول علمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است. روش PCR  تحول مهمی را در بیولوژی مولکولی پدید آورده است. با این روش می­توان قطعات DNA را از سلول­ های مختلف DNA تک رشته­ ای و یا مولکول­ های RNA و حتی DNA یک سلول را تکثیر نمود.

مخفف تست PCR  چیست؟

تست PCR مخفف واکنش زنجیره پلیمراز (Polymerase Chain Reaction (PCR)) است. منظور این است که در شرایط ازمایشگاهی میلیون ها تکثیر از یک یا چند ژن از DNA است.

کاربرد PCR چیست؟

PCR بطور کلی به دو منظور اصلی به کار می­ رود:

1. تهیه نسخه­های متعدد از یک ژن
2. بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه ­ی DNA

کاربرد دوم PCR ( برسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه ی DNA) از اهمیت بیشتری برخوردار است. چرا که از این روش می­توان جهت تشخیص بیماری­ های ژنتیکی قبل از تولد، تعیین جنسیت، بررسی عفونت­ های باکتریایی و ویروسی استفاده کرد.

موارد لازم جهت انجام PCR

برای انجام آزمایش و یا تست PCR به موارد زیر احتیاج داریم:

DNA الگو

مهم­ترین هدف از PCR تقویت DNA الگو می­باشد. DNA الگو می­تواند از ۱۰۰ تا ۳۵ هزار جفت باز طول داشته باشد. سالم بودن نمونه DNA اهمیت فراوانی در PCR دارد. همچنین کیفیت نمونه DNA، نتیجه نهایی PCR را به شدت تحت تأثیر قرار می­دهد. نمونه ناخالص ممکن است حاوی عوامل مهار کننده آنزیم DNA پلیمراز باشد که موجب کاهش بازدهی واکنش می­شود.

پرایمرها

یک جفت پرایمر الیگونوکلئوتیدی سنتزی که هر یک حدود ۲۰ نوکلئوتید هستند، با نواحی مکمل خود بر روی دو رشته­ی DNA هدف اتصال می­یابند. پس از ترکیب شدن با DNA مورد بررسی، OH انتهای΄۳ آن­ها به سمت یکدیگر جهت گیری می­نماید. در PCR معمولی غلظت­های ۱/۰ تا ۶/۰ میکرومولار پرایمرها برای واکنش مطلوب است.

آنزیم DNA پلیمراز

متداول­ترین آنزیم برای PCR ­های معمولی آنزیم مقاوم به حرارت DNA پلیمراز Taq است که معمولا بین ۵/۰ تا ۵/۲ واحد در ۵۰ میکرولیتر مخلوط PCR استفاده می­شود.

 دی اکسی نوکلئوتید ۴ نوع هستند که شامل دی اکسی آدنوزین ۵ تری فسفات (dATP)، دی اکسی سیتوزین ۵ تری فسفات (dCTP)، دی اکسی گوانوزین ۵َ تری فسفات (dGTP)، دی اکسی تایمیدین ۵َ تری فسفات (dTTP)  هستند. این نوکلئوتیدها به وسیله ­ی آنزیم DNA پلیمراز Taq بر اساس قانون بازهای مکمل واتسون و کریک به OH انتهای΄۳ پرایمر افزوده می­شوند. غلظت dNTPs به فاکتورهای متعددی از جمله غلظت MgCl_۲، غلظت پرایمرها، طول محصول تکثیر یافته و تعداد سیکل­ های PCR بستگی دارد.

PCR buffer 10X

این بافر برای حفظ pH  واکنش در محدوده مناسب استفاده می­شود و انواع مختلفی دارد که بسته به شرایط PCR انتخاب می­ شوند.

MgCl_۲

یون منیزیم با اتصال به dNTP­ها، مجموعه محلولی ایجاد می­کند که به عنوان سوبسترا برای آنزیم DNA پلیمراز Taq عمل می­کند. برای کسب بهترین نتیجه غلظت MgCl_۲ به صورت تجربی به دست می­ آید. این غلظت معمولا بین ۱ تا ۵/۱ میلی مولار است اما متداول­ ترین غلظت MgCl_۲ درPCR ، ۵/۱ میلی مولار است. اگر غلظت این ماده زیاد باشد باعث ایجاد باند­های غیراختصاصی می­شود.

 آب مقطر استریل

برای تامین محیط واکنش و کامل کردن حجم واکنش استفاده می­شود.

روش انجام ازمایش تست PCR

مراحل انجام تست PCR به شرح زیر است:

• دناتوره کردن یا واسرشت سازی

تک رشته­ای شدن DNA  در دمای بالاتر از دمای ذوب DNA که معمولا ۹۴ تا ۹۸ درجه ­ی سانتیگراد است، دناتوره شدن به DNA دو رشته­ ای گفته می­ شود. در این دما پیوندهای هیدروژنی که دو رشته را به هم متصل می­ کنند، شکسته می­ شوند.

• دمای اتصال پرایمرها

اتصال پرایمرها در دمای ۵۰ تا ۷۰ درجه­ی سانتیگراد انجام می­ گیرد. هرچه دمای اتصال در این مرحله بالاتر باشد پرایمرها به طور اختصاصی­ تر به ناحیه الگو متصل خواهند شد و احتمال اتصال اشتباه پرایمر به DNA کاهش می یابد.

• ساخته شدن یا طویل شدن پرایمرها

این مرحله در دمای ۷۲ درجه­ی سانتیگراد و به وسیله ­ی آنزیم DNA پلیمراز و Taq کاتالیز انجام  می­ گردد. آنزیم DNA پلیمراز نوکلئوتیدهای مکمل را بر اساس رشته الگو از جهت ۳ به ۵ در کنار هم قرار می­ دهد و شروع به ساختن رشته­ های مکمل می­ کند.

مدت زمان این مرحله به نوع آنزیم DNA پلیمراز و طول رشته الگو بستگی دارد. این فرایند با رساندن مجدد دما به ۹۵ درجه­ی سانتیگراد و جدا شدن رشته­ ها و سپس پایین آوردن دما تا ۵۵ درجه­ ی سانتیگراد و چسبیدن پرایمرها و بالا بردن دما تا ۷۲ درجه­ی سانتیگراد برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز Taq تکرار می­شود و بعد از هر چرخه، تعداد رشته ­ها دو برابر می­شود. هر سه مرحله در دماهای مشخص و در فواصل زمانی معین انجام می­ شوند. چرخه­ ها در دستگاه تغییر دهنده ­ی حرارتی خودکار یا ترمو سایکلر که حرارت لازم برای شروع هر مرحله را فراهم می­کند، ۴۰-۲۵ بار تکرار می­ شوند.

• الکتروفورز محصولات PCR

الکتروفورز از دو کلمه الکترو به معنای برق و فورز به معنای حمل تشکیل شده است. بطور کلی به روشی گفته می­شود که به کمک آن مواد باردار، در یک میدان الکتریکی از هم جدا می ­شوند. با توجه به باردار بودن پروتئین ­ها و اسیدهای نوکلئیک، از این روش برای جداسازی آن­ها استفاده می­ شود. با وجود این که عمل الکتروفورز را می­ توان در مایع هم انجام داد ولی چون پس از قطع جریان، نمونه­ های جدا شده مخلوط می­ شوند، این عمل را بر روی پایه­ ی جامد یا نیمه جامد انجام می­ دهند.

پایه ­ی فوق می­ تواند لایه­ی نازکی از استات سلولز باشد و یا به صورت ژل نشاسته، آگاروز یا اکریل آمید و غیره باشد. انتخاب نوع پایه بر حسب موادی که قرار است جدا شوند صورت می­ گیرد. به هر حال عمل نمونه گذاری معمولا در چاهک ­هایی که به همین منظور در ژل ایجاد شده است، انجام می­ گردد.

  روش تهیه ژل آگاروز

برای ساخت ژل آگاروز، ابتدا پودر آگاروز را در بافر مناسبی که دارای اتیلن دی آمین تترا استیک اسید EDTA می ­باشد ریخته و حرارت می­دهند، تا محلول شفاف و روشنی حاصل گردد. این عمل را می­توان با گذاشتن مخلوط بافر و آگاروز در ماکروویو انجام داد. سپس محلول را تا ۶۵ درجه­ی سانتیگراد سرد کرده و بعد به آن، اتیدیوم بروماید با غلظت ۵/۰ میکروگرم در میلی لیتر اضافه می­ شود و بعد آن را درون قالب ژل الکتروفورز می­ ریزند تا سفت گردد.

قبل از ریختن آگاروز یک شانه­ی پلاستیکی را درون قالب ژل آگاروز قرار می­دهند. این عمل بدان جهت انجام می ­شود تا دندانه ­های شانه، چاهک­ های کوچکی را در آگاروز قبل از سفت شدن تشکیل دهد. برای تعیین فاصله ­ی دندانه ­های شانه تا کف ظرف قالب می ­توان لامی را در زیر دندانه­ های شانه قرار داد و پس از تنظیم، لام را برداشته و آگاروز را اضافه کرد. زمانی که آگاروز ببندد، ماتریکس ضخیمی را تشکیل می ­دهد که به مقدار غلظت آگاروز بستگی دارد. سپس DNA  مورد نظر به درون چاهک­ ها وارد می­ شود. هنگامی که جریان برق از میان ژل عبور کند DNA که در pH خنثی دارای بار منفی است به طرف کاتد حرکت می­کند.