تست پی سی ار

آزمایش COVID-19 شامل تجزیه و تحلیل نمونه ها برای ارزیابی حضور فعلی یا گذشته SARS-CoV-2 است. دو نوع اصلی آزمایش وجود ویروس یا آنتی‌بادی‌های تولید شده در پاسخ به عفونت را تشخیص می‌دهند. آزمایش‌های مولکولی برای حضور ویروس از طریق اجزای مولکولی آن برای تشخیص موارد فردی و اجازه دادن به مقامات بهداشت عمومی برای ردیابی و مهار شیوع استفاده می‌شود.

آزمایش‌های آنتی‌بادی (سروولوژی ایمونواسی) در عوض نشان می‌دهند که آیا فردی زمانی به این بیماری مبتلا بوده است. آنها برای تشخیص عفونت های فعلی کمتر مفید هستند زیرا ممکن است آنتی بادی ها تا هفته ها پس از عفونت ایجاد نشوند. برای ارزیابی شیوع بیماری که به تخمین میزان مرگ و میر عفونت کمک می کند، استفاده می شود.

حوزه‌های قضایی فردی پروتکل‌های آزمایشی متنوعی را اتخاذ کرده‌اند، از جمله اینکه چه کسی باید آزمایش شود، هر چند وقت یکبار آزمایش شود، پروتکل‌های تجزیه و تحلیل، جمع‌آوری نمونه و استفاده از نتایج آزمون.  این تنوع احتمالاً به طور قابل توجهی بر آمار گزارش شده، از جمله تعداد موارد و آزمایش، میزان مرگ و میر موارد و جمعیت شناسی موارد تأثیر گذاشته است. از آنجا که انتقال SARS-CoV-2 چند روز پس از قرار گرفتن در معرض (و قبل از شروع علائم) اتفاق می افتد، نیاز فوری به نظارت مکرر و در دسترس بودن سریع نتایج وجود دارد.

تجزیه و تحلیل آزمایش اغلب در آزمایشگاه های پزشکی خودکار، با توان عملیاتی بالا توسط دانشمندان آزمایشگاه پزشکی انجام می شود. خودآزمایی سریع و آزمایش در نقطه مراقبت نیز در دسترس است و می‌تواند روشی سریع‌تر و کم‌هزینه‌تر برای آزمایش ویروس ارائه دهد، هرچند با دقت پایین‌تر.

تشخیص ویروس

تشخیص ویروس معمولاً یا با جستجوی RNA داخلی ویروس یا تکه‌های پروتئین در قسمت بیرونی ویروس انجام می‌شود. آزمایش هایی که به دنبال آنتی ژن های ویروسی (بخش هایی از ویروس) هستند، آزمایش آنتی ژن نامیده می شوند.

انواع مختلفی از آزمایش ها وجود دارد که با تشخیص وجود RNA ویروس به دنبال ویروس می گردند. این آزمایشات اسید نوکلئیک یا آزمایشات مولکولی، پس از زیست شناسی مولکولی نامیده می شوند. از سال ۲۰۲۱، رایج ترین شکل آزمایش مولکولی، تست واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR) است. روش‌های دیگر مورد استفاده در آزمایش‌های مولکولی عبارتند از CRISPR، تقویت اسید نوکلئیک همدما، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز دیجیتال، آنالیز ریزآرایه، و توالی‌یابی نسل بعدی.

تست واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR).

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) فرآیندی است که یک بخش کوچک و کاملاً مشخص از DNA را صدها هزار بار تقویت می کند (تکثیر می کند) و مقدار کافی از آن را برای تجزیه و تحلیل ایجاد می کند. نمونه های آزمایشی با مواد شیمیایی خاصی درمان می شوند که امکان استخراج DNA را فراهم می کند. رونویسی معکوس RNA را به DNA تبدیل می کند.

واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس (RT-PCR) ابتدا از رونویسی معکوس برای به دست آوردن DNA استفاده می کند، به دنبال آن از PCR برای تقویت آن DNA استفاده می کند و به اندازه کافی برای تجزیه و تحلیل ایجاد می کند. RT-PCR می تواند SARS-CoV-2 را که فقط حاوی RNA است، شناسایی کند. فرآیند RT-PCR معمولاً به چند ساعت نیاز دارد. به این آزمایش‌ها، سنجش‌های مولکولی یا ژنتیکی نیز گفته می‌شود.

Real-time PCR (qPCR) مزایایی از جمله اتوماسیون، توان عملیاتی بالاتر و ابزار دقیق تر را ارائه می دهد. این روش به روش ترجیحی تبدیل شده است.

تکنیک ترکیبی به عنوان RT-PCR زمان واقعی  یا RT-PCR کمی توصیف شده است و گاهی اوقات به اختصار qRT-PCR،  rRT-PCR یا RT-qPCR نامیده می شود، اگرچه گاهی اوقات از RT-PCR یا PCR استفاده می شود. دستورالعمل‌های حداقل اطلاعات برای انتشار آزمایش‌های PCR در زمان واقعی (MIQE) اصطلاح RT-qPCR را پیشنهاد می‌کند،  اما همه نویسندگان به این امر پایبند نیستند. میانگین حساسیت برای آزمایش‌های مولکولی سریع به برند بستگی دارد. برای ID NOW، میانگین حساسیت ۷۳.۰٪ با میانگین ویژگی ۹۹.۷٪ بود. برای Xpert Xpress میانگین حساسیت ۱۰۰٪ با میانگین ویژگی ۹۷.۲٪ بود.

در یک تست تشخیصی، حساسیت معیاری است که نشان می‌دهد یک تست چقدر می‌تواند مثبت واقعی را شناسایی کند و ویژگی معیاری است برای اینکه چقدر یک تست می‌تواند موارد منفی واقعی را شناسایی کند. برای همه آزمایش‌ها، چه تشخیصی و چه غربالگری، معمولاً بین حساسیت و ویژگی یک مبادله وجود دارد، به طوری که حساسیت‌های بالاتر به معنای ویژگی‌های کمتر خواهد بود و بالعکس.

حساسیت و ویژگی

یک آزمایش اختصاصی ۹۰ درصد به درستی ۹۰ درصد از افراد غیر آلوده را شناسایی می کند و ۱۰ درصد با نتیجه مثبت کاذب باقی می ماند. نمونه‌ها را می‌توان با روش‌های مختلف، از جمله سواب نازوفارنکس، خلط (مواد سرفه شده)، سواب گلو،  مواد راه هوایی عمیق که از طریق کاتتر ساکشن یا بزاق جمع‌آوری می‌شود، به دست آورد. دروستن و همکاران خاطرنشان کرد که برای سارس ۲۰۰۳، “از نقطه نظر تشخیصی، توجه به این نکته مهم است که سواب‌های بینی و گلو برای تشخیص کمتر مناسب به نظر می‌رسند، زیرا این مواد حاوی RNA ویروسی بسیار کمتری نسبت به خلط هستند، و ویروس ممکن است از تشخیص فرار کند اگر فقط این موارد باشد.

مواد آزمایش می شوند.» حساسیت نمونه های بالینی توسط RT-PCR 63% برای سواب بینی، ۳۲% برای سواب حلق، ۴۸% برای مدفوع، ۷۲-۷۵% برای خلط و ۹۳-۹۵% برای شستشوی برونش آلوئولار است.

احتمال تشخیص ویروس بستگی به روش جمع آوری و مدت زمان گذشته از عفونت دارد. با توجه به دروستن آزمایشات انجام شده با سواب گلو فقط در هفته اول قابل اعتماد است. پس از آن ویروس ممکن است گلو را رها کرده و در ریه ها تکثیر شود. در هفته دوم، جمع آوری خلط یا مجاری هوایی عمیق ترجیح داده می شود.

جمع آوری بزاق ممکن است به اندازه سواب بینی و گلو موثر باشد،  اگرچه این امر قطعی نیست. نمونه برداری از بزاق ممکن است با حذف تعامل فیزیکی نزدیک، خطر را برای متخصصان مراقبت های بهداشتی کاهش دهد. همچنین برای بیمار راحت‌تر است. افراد قرنطینه شده می توانند نمونه های خود را جمع آوری کنند. ارزش تشخیصی آزمایش بزاق به محل نمونه (گلو عمیق، حفره دهان، یا غدد بزاقی) بستگی دارد. برخی از مطالعات نشان داده‌اند که بزاق در مقایسه با نمونه‌های سواب حساسیت و قوام بیشتری دارد. در ۱۵ اوت ۲۰۲۰، FDA ایالات متحده مجوز استفاده اضطراری را برای آزمایش بزاق ایجاد شده در دانشگاه ییل اعطا کرد که نتایج را در چند ساعت نشان می‌دهد. در ۴ ژانویه ۲۰۲۱، FDA ایالات متحده هشداری را در مورد خطر نتایج کاذب، به ویژه نتایج منفی کاذب، با آزمایش RT-PCR بیدرنگ سنجش SARS-Cov-2 صادر کرد.

بار ویروسی اندازه گیری شده در نمونه های تنفسی فوقانی پس از شروع علائم کاهش می یابد. پس از بهبودی، بسیاری از بیماران دیگر RNA ویروسی قابل تشخیص در نمونه های تنفسی فوقانی ندارند. در میان افرادی که این کار را انجام می دهند، غلظت RNA سه روز پس از بهبودی عموماً کمتر از محدوده ای است که ویروس دارای قابلیت تکثیر به طور قابل اعتماد ایزوله شده است. هیچ ارتباط واضحی بین طول بیماری و مدت ریزش RNA ویروسی پس از بهبودی در نمونه‌های تنفسی فوقانی توصیف نشده است.

انواع واکنش زنجیره ای پلیمراز(PCR)

1. Real-Time PCR (quantitative PCR or qPCR): در این روش مولکول های DNA با استفاده از رنگ فلورسنت برچسب گذاری می شوند که برای نظارت و تعیین کمیت محصولات PCR در زمان واقعی استفاده می شود.
2. Reverse–Transcriptase (RT–PCR): در این روشDNA مکمل (cDNA) با روش رونویسی معکوس با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس از  RNAروی به DNA ایجاد می کند.
3. Multiplex PCR: در این روش از تعدادی پرایمر برای تکثیر چند قطعه در یک نمونه DNA استفاده می کند.
4. : Nested PCR با استفاده از ترانس کریپتاز معکوس پس از ۲۵-۳۵ چرخه اولیه  PCRیک PCR اضافی با استفاده از پرایمرهای جدید “تودرتو” در پرایمرهای اصلی انجام می شود که خطر محصولات ناخواسته را کاهش می دهد.
5. Hot Start PCR: در این روش از گرما برای دناتوره کردن آنتی بادی هایی و غیرفعال کردن Taq پلیمراز استفاده می شود.
6. Long-range PCR: در این روش توالی های بزرگی از DNA با استفاده از مخلوطی از انزیم های پلیمرازی تکثیر می دهند.
7. Assembly PCR : در این روش قطعات DNA طولانی تر با استفاده از پرایمرهای همپوشانی تکثیر می شوند.
8. Asymmetric PCR : در این روش تنها یک رشته از DNA هدف تکثیر می شوند.
9. Asymmetric PCR: این روش در سلول ها یا در بافت ثابت روی یک اسلاید انجام می شود.